Beräkna proteinmolekylarisk vikt från aminosyrasekvens för biokemiforskning och laboratorietillämpningar
Beräkning av proteinmolekylarisk vikt representerar en grundläggande uppgift inom biokemi, molekylärbiologi och bioteknikforskning som kräver noggrann summering av individuella aminosyramassor inom proteinsekvenser. Proteinmolekylarisk viktsräknaren automatiserar denna process genom att acceptera aminosyrasekvenser i standard enbokstavs- eller trebokstavskodformat, tillämpa kända molekylarvikter för var och en av de tjugo standardaminosyrorna, och ta hänsyn till peptidbildning som frigör vattenmolekyler mellan rester. Att förstå proteinmolekylarvikt är viktigt för många forsknings- och kliniska tillämpningar inklusive gelelektroforesanalys där proteiner separeras efter storlek, kromatografikolonval som beror på molekylarviktsintervall, doseringsuträkningar för terapeutiska proteiner och tolkning av masspektrometridata. Räknaren hanterar proteiner från små peptider med bara några få aminosyror till massiva multidomänproteiner som överstiger flera hundra kilodalton. Resultat kan uttryckas i flera standardenheter inklusive Dalton, kilodalton, atommassor eller gram per mol, vilket underlättar jämförelse med litteraturvärden och stödjer olika beräkningsbehov. Genom att tillhandahålla snabba, noggranna molekylarviktbestämmelser stödjer detta verktyg proteinkemiforskning, möjliggör korrekt experimentell design och hjälper forskare att tolka analytisk data korrekt.
Den matematiska grunden för att beräkna proteinmolekylarvikt summerar molekylarvikterna hos beståndsaminosyror och subtraherar vattenmolekyler förlorade under peptidbildning. Var och en av de tjugo standardaminosyrorna har en karakteristisk molekylarvikt från glycin på 75,07 Da till tryptofan på 204,23 Da, härledd från att summera atomvikterna av alla beståndskarbon-, väte-, kväve-, syre- och ibland svavelatomer. När aminosyror länkar genom peptidbindningar under proteinsyntes kondenserar karboxylgruppen av en rest med aminogruppen av nästa, frigör en vattenmolekyl på 18,01 Da per bildad bindning. För ett protein med N aminosyror blir beräkningen: Molekylarvikt = Σ(aminosyravikter) - [(N-1) × 18,01]. Till exempel skulle en tripeptid av glycin-alanin-valin beräknas som (75,07 + 89,09 + 117,15) - (2 × 18,01) = 281,31 - 36,02 = 245,29 Da. Räknaren tar också hänsyn till posttranslationella modifieringar när specificerat, inklusive disulfidbindningar mellan cysteinrester, fosforylering som tillägger fosfatgrupper, glykosylering som fäster kolhydratkedjor och andra modifieringar som signifikant ändrar molekylarvikt. Enhetskonverteringar mellan Dalton, kilodalton, atommassor och gram per mol tillämpar helt enkelt lämpliga multiplikationsfaktorer—1 kDa = 1 000 Da, och molekylarvikt i Da motsvarar numeriskt molekylarvikt i g/mol för bekväm interkonvertering.
Praktiska tillämpningar av proteinmolekylarviktberäkningar sträcker sig genom hela biokemiforskning och bioteknik. Forskare som designar SDS-PAGE gelelektroforesexperiment använder beräknade molekylarvikter för att välja lämpliga gelprocentsatser och molekylarviktsmarköruppsättningar som spänner över deras proteins förväntade storleksintervall. Kromatografimetodsutveckling kräver att man känner till proteinmolekylarvikt för att välja gelfiltrationskolumner med lämpliga fraktioneringintervall eller för att beräkna elueringsvolymer från storleksuteslutningskromatografi. Masspektometridatatolk jämför experimentella massa-till-laddningskvoter med teoretiska molekylarvikter beräknade från sekvenser, hjälper identifiera okända proteiner eller upptäcka oväntade posttranslationella modifieringar. Farmaceutisk utveckling av proteinterapeutika kräver exakt molekylarviktkunskap för doseringsuträkningar, formuleringsutveckling och regulatoriska ansökningar. Strukturbiologistudier korrelerar molekylarvikt med hydrodynamiska radiemätningar för att bedöma om proteiner existerar som monomerer, dimerer eller högre oligomerer i lösning. Proteinuttrycks- och reningsprotokoll använder molekylarvikt för att identifiera målproteiner på geler och uppskatta utbyten i massa per volymenhet. Räknaren stödjer alla dessa tillämpningar genom att tillhandahålla pålitliga teoretiska molekylarvikter som forskare jämför mot experimentella mätningar eller använder direkt i experimentell planering och dataanalys.
Specialiserade kalkylatorer för avloppsvattenhantering, husdjursvård och biologiska vetenskaper
Explore CategoryBeräknade proteinmolekylarvikter baserade på aminosyrasekvens är extremt noggranna för den teoretiska massan, vanligtvis exakta till inom 0,01 procent när korrekta atomvikter och beräkningsmetoder används. Emellertid beror förhållandet mellan beräknade och experimentellt observerade molekylarvikter på proteinets faktiska tillstånd. Nativa proteiner har ofta posttranslationella modifieringar—fosforylering, glykosylering, acetylering, ubiquitinering—som tillägger betydande massa bortom den beräknade sekvensbaserade vikten. Glykosylerade proteiner kan bära kolhydratkedjor som tillägger 10-50 procent eller mer till sekvensbaserade beräkningar. Disulfidbindning minskar något massan med 2 Da per bindning när väteatomer förloras. Proteolytisk bearbetning som tar bort signalpeptider eller andra sekvenser minskar faktisk massa under sekvensbaserade förutsägelser. För denaturerade, omodifierade proteiner analyserade med masspektrometri överensstämmer beräknade och observerade värden vanligtvis inom 0,1 procent, validerar sekvensnoggrannhet. För nativa proteiner med okända modifieringar kan experimentell massa skilja sig betydligt från beräknade värden, med skillnaden avslöjar omfattningen av posttranslationell bearbetning. Forskare som arbetar med rekombinanta proteiner uttryckta i bakterier får ofta utmärkt överensstämmelse mellan beräknade och observerade massor eftersom E. coli utför begränsad posttranslationell modifiering.
Dalton (Da) och kilodalton (kDa) är massenheter som används specifikt för att uttrycka molekylarvikter av proteiner, peptider och andra biomolekyler, med en kilodalton helt enkelt lika med 1 000 Dalton. Dalton definieras som en tolftedel massan av en kol-12-atom, vilket gör den väsentligen identisk med atommassan (amu eller u) som används i kemi. Biokemister föredrar Dalton framför amu för att hedra John Dalton och skilja biologiska makromolekylers massor från små molekylvikter. Små peptider och individuella aminosyror uttrycks vanligtvis i Dalton—glycin har molekylarvikt 75 Da, insulin 5 808 Da. Större proteiner använder kilodalton för bekvämlighet—humant serumalbumin väger cirka 66 kDa snarare än 66 000 Da. Molekylarvikt i Dalton är numeriskt lika med molekylarvikt i gram per mol, så ett 50 kDa-protein väger 50 000 gram per mol. Denna ekvivalens förenklar koncentrationsberäkningar i biokemilaboratorier. När man refererar till proteinstorlekar på geler eller i litteraturen säger forskare vanligtvis "ett 50 kDa-protein" eller "springer på 50 kD" på SDS-PAGE. Räknaren tillåter utdata i någon av dessa enheter för att matcha användarpreferens eller tidskriftsinlämningskrav, med automatisk konvertering mellan dem.
Posttranslationella modifieringar kan dramatiskt ändra proteinmolekylarvikt bortom värden beräknade från enbart aminosyrasekvens. Glykosylering, där kolhydratkedjor fäster vid asparagin-, serin- eller treoninrester, tillägger vanligtvis 1 000-30 000 Da eller mer beroende på sockerkjedans storlek och antal glykosyleringställen—tungt glykosylerade proteiner kan bära kolhydrater som representerar 30-80 procent av total massa. Fosforylering tillägger 80 Da per fosfatgrupp, med multisite-fosforylering på proteiner som kasein tillägger flera hundra Dalton. Acetylering tillägger 42 Da per modifierad lysin eller N-terminus. Metylering tillägger 14 Da per metylgrupp. Ubiquitinering fäster ett 8,5 kDa ubiquitinprotein till lysinrester, med poly-ubiquitinkedjor tillägger multipler av denna massa. Disulfidbindning mellan cysteinpar minskar massan med 2 Da per bindning när väteatomer förloras. Proteolytisk klyvning av signalpeptider, prosekvenser eller interna domäner kan ta bort kilodalton till tiotals kilodalton från prekursorproteiner. Lipidation som fäster fettsyra eller prenylgrupper tillägger hundratals Dalton. Den samlade effekten av flera modifieringar betyder att mogna proteiner ofta skiljer sig väsentligt från sekvenspredikterade vikter. Masspektrometri kan exakt mäta total modifierad massa, med skillnaden från beräknad sekvensvikt avslöjar den kombinerade massan av alla modifieringar.
Ja, molekylarvikt möjliggör konvertering mellan masskoncentration (mg/mL eller g/L) och molär koncentration (µM eller mM), vilket visar sig vara väsentligt för biokemisk experimentering. Förhållandet är: Molär Koncentration (M) = Masskoncentration (g/L) ÷ Molekylarvikt (g/mol). Till exempel en lösning som innehåller 5 mg/mL av ett 50 kDa-protein motsvarar 5 g/L ÷ 50 000 g/mol = 0,0001 M = 100 µM. Omvänt, att uppnå en önskad molär koncentration kräver: Masskoncentration (mg/mL) = [Molär Koncentration (M) × Molekylarvikt (g/mol)] ÷ 1 000. Att förbereda 1 mM-lösning av det 50 kDa-proteinet kräver (0,001 M × 50 000 g/mol) ÷ 1 000 = 50 mg/mL. Denna konvertering är viktig eftersom enzymkinetik, bindningsstudier och annan kvantitativ biokemi vanligtvis kräver molära koncentrationer för att återspegla faktiska molekylantal, medan proteinkvantifieringsmetoder som Bradford eller BCA-analyser mäter masskoncentration. Spektrofotometrisk koncentrationsbestämning använder absorbans vid 280 nm kombinerat med proteinets extinktionskoefficient och molekylarvikt för att beräkna koncentration. Att känna till molekylarvikt möjliggör också beräkning av molekyler per cell eller per volym för cellbiologitillämpningar, stödjer experimentell design och datatolk genom biokemiska discipliner.
Proteiner migrerar ofta vid skenbara molekylarvikter som skiljer sig från beräknade värden på SDS-PAGE-geler på grund av flera faktorer som påverkar elektroforetisk mobilitet. Tungt glykosylerade proteiner springer långsammare (verkar större) än deras sekvenspredikterade vikt eftersom fästa kolhydrater tillägger massa men binder mindre SDS per massenhet jämfört med polypeptider, minskar övergripande negativ laddningstäthet och bromsar migration. Extremt sura eller basiska proteiner med ovanliga aminosyrasammansättningar kan binda onormala mängder SDS, ändrar laddning-till-massa-kvoter och mobilitet. Ofullständig proteindenaturering tillåter kvarvarande struktur att påverka migration—proteiner med flera disulfidbindningar inte helt reducerade kan behålla kompakta konformationer som migrerar snabbare än helt uppvecklade ekvivalenter. Mycket små peptider under cirka 10 kDa springer ibland anomalt snabbt. Stavformade fibrösa proteiner som kollagen migrerar långsammare än globulära proteiner av liknande massa. Posttranslationella modifieringar bortom glykosylering—omfattande fosforylering, ubiquitinering, SUMOylering—ändrar både massa och laddning, påverkar migration. Proteinaggregering eller ofullständig solubilisering orsakar långsammare migration eller misslyckande att komma in i geler. För noggrann molekylarviktsuppskattning med SDS-PAGE, inkludera molekylarviktsstandarder som spänner över förväntat intervall, säkerställ fullständig denaturering och reduktion, och inse att ovanliga proteiner kan kräva alternativa karakteriseringsmetoder som masspektrometri eller storleksuteslutningskromatografi för noggrann massbestämning.